引用本文
孙娟, 何青青, 徐荣, 宋祖华. 水环境中26种类固醇激素的分析方法研究[J]. 环境监控与预警, 2019, 11(6): 18-23.  
SUN Juan, HE Qing-qing, XU Rong, SONG Zu-hua. Research on the Analysis Method of 26 Steroid Hormones in Water Environment[J]. Environmental Monitoring and Forewarning, 2019, 11(6): 18-23.  
水环境中26种类固醇激素的分析方法研究
孙娟, 何青青, 徐荣, 宋祖华     
江苏省南京环境监测中心，江苏 南京 210013
收稿日期: 2019-08-19; 修订日期: 2019-09-15
基金项目: 2018年南京环保科研基金资助项目(201801)
作者简介: 孙娟(1983—)，女，高级工程师，本科，从事环境监测理化分析与质量管理工作.
摘要: 建立了固相萃取-超高效液相-串联质谱法同时测定水环境中26种类固醇激素的分析方法。明确了取样体积为500 mL，Cleanert PEP为富集柱，乙酸乙酯为洗脱剂，甲醇为溶剂进行提取操作。选择了正离子模式，以0.1%甲酸/甲醇-水为流动相，负离子模式以0.1%氨水/乙腈-水为流动相，试样经AcquityTMUPLC BEH C18色谱柱分离后，选用质谱检测模式进行定性、定量分析。通过方法验证，26种类固醇激素的方法检出限为0.3~1.5 ng/L，测定下限为1.2~6.0 ng/L，代表性样品测定结果的相对标准偏差为2.6%~13.7%(n=6)，加标回收率为71.2%~121%。该方法操作便捷，灵敏度高，精密度和准确度良好，可适用于水环境中多种痕量、超痕量类固醇激素的定性定量分析。
关键词: 水环境    类固醇激素    固相萃取    超高效液相色谱    串联质谱    
Research on the Analysis Method of 26 Steroid Hormones in Water Environment
SUN Juan, HE Qing-qing, XU Rong, SONG Zu-hua     
Jiangsu Nanjing Environmental Monitoring Center, Nanjing, Jiangsu 210013, China
Abstract: In this paper, an analytical method was developed for simultaneous determination of 26 kinds of steroid hormones in water environment by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry. A 500 mL sample was extracted by passing it through a Cleanert PEP column, target analytes were eluted from the SPE column by ethyl acetate. A solvent exchange is necessary to avoid incompatible with solid phase, so methanol was used as the final solvent. The target analytes were separated by AcquityTMUPLC BEH C18 chromatographic column and the matched mass spectrometry detection mode was selected for qualitative and quantitative analysis.Positive ion mode was selected with methanol-water as mobile phase and negative ion mode with acetonitrile-water as mobile phase.Method validation results showed that the detection limits of 26 kinds of steroid hormones were between 0.3~1.5 ng/L, the lower limits were between 1.2~6.0 ng/L, the relative standard deviations of representative samples were between 2.6%~13.7% (n=6), and the standard recovery rates were between 71.2%~121%. The results indicated that this method was convenient, sensitive, precise and accurate. So it could be used for qualitative and quantitative analysis of steroid hormones in water environment.
Key words: Water environment    Steroid hormones    Solid phase extraction    Ultra performance liquid chromatography    Tandem mass spectrometry    

类固醇激素包括雌激素、雄激素、孕激素和皮质激素4大类，因在免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制等方面具有显著药物作用而被广泛使用[1-2]。环境中类固醇激素主要来源于生物体排泄物及人工合成激素，经过自然或人为途径进入大气、水体或土壤中，持续地干扰生物体内分泌[3]。研究表明[4]，当水体中雌激素质量浓度为5~6 ng/L，可致使水中鱼类灭绝。水环境是所有生物体赖以生存的重要资源，也是污染物在环境中的主要载体，类固醇激素经过持续输入和长期存在直接影响到水环境安全[5-6]。因此，建立灵敏度高、选择性好、精准快速的水环境中多种类固醇激素同时测定的分析方法具有重要意义。

目前，水环境中类固醇激素的分析方法主要有气相色谱-串联质谱法[7-9]、放射性免疫法、酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法[10-15]。因目标物挥发性较弱，采用气相色谱-串联质谱法，需要对样品进行复杂的衍生化；放射性免疫法和酶联免疫法属于生物技术，因容易受样品中共存物质干扰而需要进行较烦琐的萃取、分离等预处理，更适用于微量分析；超高效液相色谱-三重四极杆质谱法可显著降低样品和试剂的消耗量，避免衍生化带来的副反应及多步预处理造成的损失，极大提高分析的分离度、灵敏度和精准度。因此，根据类固醇激素种类繁多、结构相似、浓度较低、干扰不明等特点，配制ng/L质量浓度水平的标准溶液，通过空白水样加标实验确定固相萃取预处理与色谱质谱条件，并选取代表性水环境样品进行方法学验证。

1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂

仪器：Waters AcquityTM系列超高效液相色谱仪，配有AcquityTM UPLC BEH C18液相色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm，美国沃特世公司)；SCIEX API 4000+型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)(美国AB公司)；Auto Vap S8 Plus型自动氮吹仪(美国ATR公司)；GX-274 ASPEC型全自动固相萃取仪(美国吉尔森公司)；Qasis HLB 500 mg/6 mL型小柱(美国沃特世公司)；Cleanert PEP 500 mg/6 mL型小柱(天津艾杰尔公司)；Supelclean LC-18 500 mg/6 mL型小柱(美国色谱科公司)；Milli-Q Reference型超纯水机(美国密理博公司)。

试剂：标准物质包括6种雄激素(群勃龙、诺龙、雄烯二酮、睾酮、甲基睾酮、康力龙)，6种孕激素(炔诺酮、孕酮、羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮)，7种雌激素(雌三醇、雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、戊酸雌二醇)，7种糖皮质激素(泼尼松、氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、六甲强龙)，纯度95.4%~99.9%，均购自德国Dr.Ehrensorfer公司；甲酸、氨水、甲醇、乙腈和乙酸乙酯(HPLC级，美国Baker公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量26种类固醇激素标准物质于50 mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度为50.0 mg/L的标准储备液，于2~5 ℃下避光冷藏。根据目标化合物仪器响应结果不同，分别准确移取适量上述储备液，甲醇定容配制质量浓度为0.200~2.00 mg/L的混合标准中间液。

1.3 水样预处理方法

取经0.45 μm水系微孔滤膜过滤后的水样500 mL于固相萃取仪取样杯中，将依次经6 mL甲醇和6 mL超纯水活化后的SPE小柱安装在固相萃取收集装置处，设置水样以4~5 mL/min的速度通过小柱，待样品收集完后，用5~6 mL纯水淋洗小柱并经15~30 min氮吹至干(柱中填料呈明显流沙状)；先用10~12 mL乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液于100 mL氮吹管中，设置40 ℃氮吹至近干(余2~3滴)，再用甲醇定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后全部转移至棕色进样瓶中待测。

1.4 色谱与质谱条件 1.4.1 色谱条件

色谱柱设置35 ℃柱温，进样体积为5.0 μL，流速为0.10 mL/min。采用ESI+模式时，A1为0.1%的甲酸，B1为甲醇。洗脱梯度：0~0.5 min，28%B1；0.5~10 min，28%~65%B1；10~15 min，65%~75%B1；15~18 min，75%~55%B1；18~20 min，55%~28%B1。采用ESI-模式时，A2为0.1%的氨水，B2为乙腈。洗脱梯度：0~0.5 min，40%B2；0.5~9 min，40%~70%B2；9~15 min，70%~90%B2；15~17 min，90%~40%B2。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；离子化电压：ESI+为5 500 V，ESI-为4 500 V；选择MRM多反应监测模式；离子源温度为350 ℃；喷雾气、气帘气和辅助加热气均为172 kPa高纯氮气。26种目标化合物的质谱参数见表 1。

表 1 26种目标化合物的质谱参数①
化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 保留时间/ min 碰撞能量/ eV 去簇电压/ V 碰撞室出口电压/ V 电离模式
泼尼松 359.0 147.3* 8.55 38 75 9 +
237.2 29 15 +
氢化泼尼松 361.1 147.3* 9.26 30 66 8 +
171.1 37 10 +
倍他米松 393.5 373.2* 10.39 13 69 21 +
355.3 17 19 +
地塞米松 393.5 373.3* 10.56 13 69 21 +
355.4 18 20 +
醋酸泼尼松龙 403.4 385.4* 10.78 15 58 18 +
307.5 18 15 +
醋酸氢化可的松 405.1 241.1* 10.79 31 95 16 +
121.5 43 7 +
六甲强龙 375.4 357.4* 10.9 15 62 10 +
339.3 15 24 +
群勃龙 271.4 199.1* 11.26 32 104 12 +
107.0 44 6 +
雄烯二酮 287.3 97.2* 12.30 29 96 19 +
109.3 34 7 +
诺龙 275.4 109.2* 12.41 37 103 7 +
145.2 30 10 +
炔诺酮 299.3 109.2* 12.42 41 95 6 +
231.3 25 15 +
睾酮 289.3 97.1* 13.70 32 99 15 +
109.3 35 6 +
羟孕酮 331.3 97.0* 13.94 39 95 19 +
109.3 40 6 +
左炔诺孕酮 313.3 109.2* 14.22 38 99 7 +
245.4 25 16 +
甲基睾酮 303.3 97.2* 14.58 38 108 18 +
109.3 37 6 +
醋酸甲地孕酮 285.5 267.3* 15.62 25 82 16 +
325.5 20 18 +
醋酸甲羟孕酮 387.6 285.4* 15.99 25 86 18 +
123.5 40 12 +
康力龙 329.4 81.2* 16.56 68 140 8 +
95.5 57 7 +
孕酮 315.2 97.0* 16.64 33 90 19 +
109.3 35 6 +
雌三醇 287.1 171.2* 3.47 -48 -136 -18 -
145.2 -53 -8 -
雌二醇 271.1 145.1* 5.46 -54 -130 -8 -
182.9 -52 -15 -
炔雌醇 295.4 145.2* 5.80 -53 -125 -8 -
159.0 -47 -15 -
己烯雌酚 266.9 237.0* 6.02 -38 -98 -12 -
222.1 -46 -10 -
雌酮 268.9 145.1* 6.07 -52 -116 -13 -
159.0 -47 -11 -
己烷雌酚 268.9 118.9* 6.23 -48 -82 -11 -
133.0 -22 -8 -
戊酸雌二醇 355.5 100.9* 14.11 -42 -120 -18 -
253.3 -40 -8 -
① *为定量离子。
表选项

2 结果与讨论 2.1 优化固相萃取条件

26种目标化合物的极性范围由强到弱排列为糖皮质激素、雄激素、孕激素和雌激素，其辛醇水分配系数范围依次为1.24~2.06，2.45~4.42，2.97~3.51，2.45~5.64，水样预处理环节主要考虑固相萃取柱、洗脱液及不同pH值条件对26种目标化合物富集提取效率的影响。选取常用于水样分析的二乙烯基苯-N-乙烯苯吡咯烷酮共聚物填柱(HLB柱)、十八烷基硅烷键合硅胶填柱(LC-18柱)和聚苯乙烯-二乙烯苯填柱(PEP柱)3种固相萃取柱，以及甲醇、乙腈和乙酸乙酯3种常用洗脱溶剂(单次用量10 mL)为筛选对象[16]，按照1.3和1.4步骤对空白水样进行加标回收实验，加标质量浓度为100 ng/L，实验结果(n=6)见图 1(其中ESI－模式测定的7种雌激素回收率结果用柱状图表示)。HLB柱、PEP柱具有类似的交联网状构成且均含有特定比例的亲水基和疏水基，与LC-18柱相比更适用于具有弱极性、极性目标化合物的大体积富集，考虑到HLB柱成本高出PEP柱近40%，结合最佳加标回收结果(PEP/乙酸乙酯，74.3%~106%)，故选择PEP柱富集，乙酸乙酯溶剂洗脱。

图 1 不同固相萃取柱和洗脱液条件下的加标回收结果
图选项

同时，选择甲酸和氢氧化钠将水样pH值调节为3.0，7.0和10.0，通过加标回收实验(n=6)，验证不同pH值水样的PEP柱适用性。经对比，pH值=3.0时，戊酸雌二醇的加标回收率＜50.0%；pH值=7.0时，26种目标化合物的加标回收率稳定在72.0%~110%；pH值=10.0时，醋酸泼尼松龙的加标回收率＜20.0%，醋酸氢化可的松的加标回收率＜5.0%。因此，为保证各目标化合物的固相萃取柱效率，预处理前应调节水样pH值至近中性。

2.2 确定离子源与流动相

分别选择电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)，对质量浓度为100 ng/L的同一混合标准样品进行定性、定量分析。经比较，APCI源测试灵敏度低于ESI源，因超高效液相色谱柱填料比较微小，受柱压限制，流速和进样体积均比较小，APCI源的灵敏度难以大幅改善，故选择ESI源为离子源。

由于电喷雾过程在液态下进行，流动相的组成配比直接影响目标化合物的离子化效率。经比较，ESI+模式下，0.1%甲酸/甲醇-水流动相能提高雄激素、孕激素和糖皮质激素的离子化效率，改善峰形；ESI-模式下，0.1%氨水/乙腈-水流动相有利于雌激素的离子化效率，提高测试灵敏度。再比较0.08，0.10和0.12 mL/min不同流速下的测试结果，发现流量为0.08 mL/min时，目标化合物的峰展宽增加，拖尾严重，影响定量；流量为0.12 mL/min时，柱压上升40%且目标化合物分离度均＜1.0；而流量为0.10 mL/min时，峰形较优、分离效果较好，因此选择此流速为流动相工作流速。

2.3 检出限与测定下限

根据各种目标化合物响应值，准确移取1.2中混合标准中间液25.0 μL于5.00 mL容量瓶中，用甲醇定容制得质量浓度为1.00~10.0 μg/L的混合标准使用液，分别移取2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100和200 μL的混合标准使用液至1.00 mL容量瓶中，用甲醇定容制得标准系列溶液。按照浓度由低到高的顺序依次进样，以质量浓度为横坐标、响应值为纵坐标绘制标准曲线。准确移取混合标准使用液1.00 mL至500 mL水样中，重复制得7份样品，按照1.3和1.4的步骤进行平行测试，统计7次测定结果的标准偏差(S)，MDL=t(0.99，n-1)×S(n为样品的平行测定次数；t为自由度为n-1，置信度为0.99时的t值)，测定下限以检出限的4倍计算[17]。方法线性方程、线性范围、相关性、检出限与测定下限结果见表 2。

表 2 26种目标化合物的线性方程、线性范围、相关性、检出限与测定下限统计结果
化合物 线性方程 线性范围/(ng·L-1) 相关系数(r) 检出限/(ng·L-1) 测定下限/(ng·L-1)
泼尼松 y=4 976 x+2 371 2.00~200 0.999 7 0.4 1.6
氢化泼尼松 y=7 754 x+2 059 2.00~200 0.999 9 0.4 1.6
倍他米松 y=13 472 x+6 043 5.00~500 0.998 7 0.8 3.2
地塞米松 y=13 671 x+5 649 5.00~500 0.998 9 0.8 3.2
醋酸泼尼松龙 y=14 636 x+3 257 2.00~200 0.999 8 0.4 1.6
醋酸氢化可的松 y=12 688 x+3 782 10.0~1 000 0.999 7 1.3 5.2
六甲强龙 y=34 845 x+2 099 2.00~200 0.999 5 0.4 1.6
群勃龙 y=3 693 x+361 5.00~500 0.999 2 0.8 3.2
雄烯二酮 y=34 845 x+2 099 2.00~200 0.999 8 0.3 1.2
诺龙 y=6 763 x+2 216 5.00~500 0.999 5 0.8 3.2
炔诺酮 y=8 821 x+2 069 5.00~500 0.999 6 0.6 2.4
睾酮 y=22 167 x+353 2.00~200 0.999 5 0.3 1.2
羟孕酮 y=12 999 x-1 226 2.00~200 0.999 5 0.4 1.6
左炔诺孕酮 y=6 889 x-809 5.00~500 0.999 8 1.0 4.0
甲基睾酮 y=17 237 x-267 2.00~200 0.999 8 0.3 1.2
醋酸甲地孕酮 y=11 432 x+643 2.00~200 0.999 7 0.3 1.2
醋酸甲羟孕酮 y=3 598 x+4 752 5.00~500 0.998 3 0.8 3.2
康力龙 y=21 019 x+843 2.00~200 0.999 9 0.3 1.2
孕酮 y=26 348 x+9 638 2.00~200 0.998 8 0.3 1. 2
雌三醇 y=2 097 x+1 267 10.0~1 000 0.999 6 1.3 5.2
雌二醇 y=4 226 x+2 734 5.00~500 0.999 5 0.7 2.8
炔雌醇 y=2 796 x+1 309 10.0~1 000 0.999 2 1.5 6.0
己烯雌酚 y=9 904 x+3 536 2.00~200 0.999 4 0.3 1.2
雌酮 y=15 933 x+3 430 10.0~1 000 0.999 0 1.4 5.6
己烷雌酚 y=19 756 x+3 103 2.00~200 0.999 5 0.3 1.2
戊酸雌二醇 y=23 352 x-2 079 2.00~200 0.999 1 0.3 1.2
表选项

由表 2可见，26种目标化合物在各自线性范围内的线性关系良好，相关系数为0.998 3~0.999 9，检出限为0.3~1.5 ng/L，测定下限为1.2~6.0 ng/L，能够满足水环境中26种类固醇激素ng/L级的测试需求。

2.4 精密度与准确度

选取饮用水源水、湖水、内河水、池塘水、井水、污水6类水样进行方法学验证，计算水样平行测定多次(n=6)结果的相对标准偏差(RSD)，根据水样中目标化合物的质量浓度水平，分别进行4.00，20和200 ng/L不同加标量的回收实验。方法精密度和加标回收率结果见表 3。经统计，不同水样中26种类固醇激素的检出率为7.7%~34.6%，其中倍他米松、地塞米松、雄烯二酮、诺龙、炔诺酮、睾酮、醋酸甲地孕酮、康力龙、孕酮、雌三醇、雌二醇、雌酮、己烷雌酚和戊酸雌二醇被检出且浓度水平较低，醋酸泼尼松龙和醋酸甲羟孕酮被显著检出，最大质量浓度＞30 ng/L。实际水样平行测定结果的RSD为2.6%~13.7%(n=6)，加标回收率为71.2%~121%，方法的精密度和准确度良好。

表 3 实际水样的精密度和加标回收率实验统计结果(n=6)①
化合物 检出质量浓度/(ng·L-1) RSD/% 加标回收率/%
饮用水源水 湖水 内河水 池塘水 井水 污水 检出限
泼尼松 — — — — — — 0.4 3.9~8.0 95.9~105
氢化泼尼松 — — — — — — 0.4 3.2~5.7 89.3~102
倍他米松 — — — 0.91 — — 0.8 4.7~8.3 97.1~101
地塞米松 — — 0.83 — — — 0.8 3.9~7.6 93.5~106
醋酸泼尼松龙 — 14.7 — — 0.64 38.2 0.4 3.7~6.0 92.3~109
醋酸氢化可的松 — — — — — — 1.3 4.0~5.9 94.2~106
六甲强龙 — — — — — — 0.4 4.1~7.3 99.0~110
群勃龙 — — — — — — 0.8 5.0~6.7 78.8~93.4
雄烯二酮 — 0.77 — — — 1.02 0.3 3.8~7.4 97.4~107
诺龙 — — — — — 2.51 0.8 2.7~6.5 95.9~113
炔诺酮 — — 0.69 — — — 0.6 4.1~8.0 102~109
睾酮 — 0.83 — 0.95 — 1.18 0.3 3.9~11.2 90.7~115
羟孕酮 — — — — — — 0.4 6.2~13.1 94.9~119
左炔诺孕酮 — — — — — — 1.0 4.6~10.8 103~121
甲基睾酮 — — — — — — 0.3 2.6~9.4 97.5~109
醋酸甲地孕酮 0.59 — 0.38 — — — 0.3 5.1~7.6 89.9~114
醋酸甲羟孕酮 — — 20.3 7.11 — 34.9 0.8 6.2~9.5 95.3~121
康力龙 — 0.35 — — 0.45 — 0.3 4.8~9.0 76.4~83.6
孕酮 — — — 1.05 0.39 0.71 0.3 2.9~10.0 101~118
雌三醇 — — — — — 1.89 1.3 3.4~13.7 71.2~77.6
雌二醇 — — — — — 2.4 0.7 2.6~6.1 91.4~96.7
炔雌醇 — — — — — — 1.5 2.9~6.8 99.2~116
己烯雌酚 — — — — — — 0.3 3.1~10.2 76.3~87.1
雌酮 — — 1.45 — 1.61 — 1.4 2.9~5.6 99.4~110
己烷雌酚 — — — — — 0.42 0.3 3.7~11.3 92.1~103
戊酸雌二醇 0.47 0.93 — 0.50 0.62 — 0.3 2.8~9.7 72.3~80.6
① —表示未检出。
表选项

3 结语

建立了固相萃取-超高效液相-串联质谱法同时测定水环境中26种类固醇激素的分析方法。对饮用水源水、湖水、内河水、池塘水、井水、污水6类水样进行测试，方法稳定高效、适用性良好，26种目标化合物检出率为7.7%~34.6%，醋酸泼尼松龙在湖水、污水中的检出质量浓度分别为14.7和38.2 ng/L；醋酸甲羟孕酮在池塘水、内河水、污水中均有明显检出，检出质量浓度分别为7.11，20.3和34.9 ng/L。该方法操作便捷，灵敏度高，精密度和准确度良好，可适用于水环境中多种痕量至超痕量类固醇激素的定性、定量分析。

参考文献
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